Até o início dos anos 1990, se explicava que a resolução de um instrumento óptico era limitada pela frequência, a qual para um microscópio clássico não deveria ser menor do que 0,2 nanômetro. Substituir a luz por um fluxo de elétrons seria então o único método capaz de fazer isto melhor. O Prêmio Nobel de 2014 acaba de recompensar três cientistas por ter levado bem mais longe as possibilidades do microscópio óptico, também chamado "fotônico", jogando habilmente com a técnica de microscopia de fluorescência, conhecida desde o início do século XX.

Através da adição de moléculas fluorescentes a uma preparação, da mesma maneira que os corantes são usados pelos biólogos, foi possível colocar em evidência mais facilmente, determinadas famílias de certas moléculas ou estruturas. A genética permitiu o avanço desta técnica, incluindo nos genes uma molécula fluorescente, como a GFP (Green Fluorescent Protein) ou a DsRed, na proteína que você deseja rastrear. Esta técnica tinha feito com que Roger Tsien, Osamu Shimomura e Martin Chalfie ganhassem o Prêmio Nobel de 2008.


Astúcias para melhorar o microscópio de fluorescência

Em 2000, Stefan W. Hell, do Instituto Max Planck, na Alemanha conseguiu desenvolver uma técnica de microscopia baseada na fluorescência batizada com o nome de STED (Stimulated Emission Depletion), que pode se traduzida como microscopia de perda por emissão estimulada. Neste dispositivo, a fluorescência é iniciada localmente (por estimulação luminosa, o que faz com que os átomos passem para o estado excitado), no ponto a ser observado, pela irradiação de um primeiro laser. A luz emitida (com uma frequência diferente daquela da estimulação) forma uma macha larga, o que reduz a resolução. Entretanto, uma segunda radiação laser "apaga", literalmente, a luz emitida ao redor deste ponto. Esta extinção é obtida através do ajuste da frequência da radiação laser de sorte que os átomos excitados voltem ao estado fundamental através da emissão de um fóton de mesma frequência que a radiação de estimulação e, por conseguinte, de cor diferente da fluorescência recolhida pelo microscópio.

Imagens de partículas coloidais (200 nm de diâmetro) obtidas, à esquerda, com um microscópio confocal, à direita com o dispositivo STED. Duas magnificações são apresentadas: um mícron nas imagens de grandes dimensões e 250 nm nas de pequenas.

Créditos: Benjamin Harke, Jan Keller, Chaitanya K. Ullal, Volker Westphal, Andreas Schönle, Stefan W. Inferno

Eric Betzig e William Moerner, ambos trabalharam com a "espectroscopia monomolecular", nos Estados Unidos, porém independentemente, ou seja, Betzig no Howard Hughes Medical Institute e Moerner na Universidade de Stanford. A técnica consiste em iniciar a fluorescência de algumas moléculas através de várias estimulações curtas. Uma sucessão de imagens é obtida o que permite reconstituir as posições das moléculas individuais. A primeira imagem foi obtida por Eric Betzig em 2006. A resolução chegou "ao nível nanométrico", explica o júri do Prêmio Nobel, que fala então de "nanoscopia".

Princípio da microscopia STED. Uma pequena zona da amostra é iluminada por um primeiro laser (à esquerda). Ao centro um segundo feixe, anular, "apaga" as moléculas fluorescentes. Finalmente, a radiação luminosa recolhida, à direita, é obtido um ponto de pequena dimensão.

Créditos: Marcel Lauterbach

Como o Prêmio Nobel de Física de 2014, atribuído aos inventores do LED azul, esta recompensa foi também uma surpresa. Stefan Hell confidenciou à imprensa que quando recebeu a notícia do prêmio estava mergulhado na leitura de um artigo e que pensou que tudo seria uma farsa. Desde as primeiras lupas de Galileu, aos modelos de Antonie van Leeuwenhoek, que no século XVII tanto agradava aos biólogos, aos microscópios eletrônicos, aos de tunelamento ou aos de força atômica, estes equipamentos sempre fizeram avançar não só a física como a medicina. Baixar os limites de resolução conhecidos é, obviamente, sempre de grande importância.

Futura Sciences (Tradução - OLA).

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